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        雙熒光素酶報告基因檢測


         

        熒光素酶報告實驗由于其快捷、廉價、靈敏度高和可定量等優點,已普遍用于細胞生物學的研究,如基因表達轉錄水平的研究。熒光素酶報告系統屬于生物發光系統,其中的熒光素酶來自于不同生物體內的氧化酶,很多物種(細菌、海洋動物、昆蟲等)中都含有熒光素酶,其中應用比較廣泛的是熒火蟲熒光素酶。它可以在一定條件下與底物發生化學反應產生可檢測到的光,產生光的過程中幾乎不產生熱量,也就是說這個過程中幾乎所有的能量全部轉化為光能,這使得檢測的靈敏度非常高。下面以報告基因實驗(啟動子)為例,來介紹雙熒光素酶報告系統。
         

         

         

         熒光素酶反應原理

         
        報告基因實驗常用于研究目的基因的調控元件(啟動子、增強子等),調控元件的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合,從而對基因的表達起抑制或增強的作用。整個報告基因的核心是將待定的調控元件與報告基因進行融合,檢測報告基因的表達。由于報告基因的表達完全取決待定的調控元件,故報告基因的表達量與待定調控元件的活性直接相關。一個好的報告基因必須滿足以下條件:
        (1)在所檢測的細胞內不存在;
        (2)檢測起來非常方便;
        (3)靈敏度要高,最好可以定量。相比于傳統的β-半乳糖苷酶(LacZ,真核生物內有內源性干擾)、氯霉素乙酰轉移酶(CAT,檢測復雜)、熒光蛋白(GFP、YFP、RFP等,靈敏度不高,有些細胞有自發熒光現象),熒光素酶檢測系統具有明顯的優勢。
         

         

         
        熒光素酶報告實驗圖解

         
        由于熒光素酶超級靈敏的能力和寬廣的動力學范圍,熒光素酶系統得到了廣泛的使用。通常熒光素酶的實驗會將待檢測的調控元件(啟動子)安排在熒光素酶基因的上游,構建成載體,然后將構建完成的載體導入到合適的動物細胞中,通過檢測熒光素酶的活性來判斷調控元件的活性。
        在熒光素酶報告系統中,只使用一種熒光素酶(一般為熒火蟲熒光素酶),為單熒光素酶報告實驗;由于不同的熒光素酶所發出的光具有不同的光譜性質,或使用不同的底物,一個報告實驗中也可以使用兩種或多種熒光素酶,其中最常用到的就是雙熒光素酶(一般為熒火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶)報告實驗,其中一種熒光素酶作為報告基因,另一種則作為內參,主要作用是減少外界因素對于實驗數據產生的影響,這些影響主要包括操作誤差、細胞接種差異、細胞處理的誤差、孔間增殖差異等因素。因此,在調控元件(啟動子、增強子)的研究中,雙熒光素酶報告實驗應用的會更多一些,整個的實驗過程也非常的簡便,如下圖所示。
         

         

         
          熒光素酶報告實驗流程

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