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        熒光定量PCR檢測

         

        熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的最普遍的方法,通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對產物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。Sybr green在低樣本量時成本較低,目前選用的較多。

        SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合時,發出熒光;從DNA雙鏈上釋放出來時,熒光信號急劇減弱。因此,在一個體系內,其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是:1、開始反應,當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性時,SYBR Green染料釋放出來,熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中,引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后,SYBR Green染料與雙鏈產物結合,定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。


        實驗流程細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。


         

        結果示例:

        A 基因擴增曲線圖;B 基因擴增溶解曲線圖;C mRNA相對表達量變化 

        從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果,溶解曲線可以看出引物識別特異性情況,通過使用&Delta;&Delta;Ct方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。

        更多關于pcr檢測的干貨:pcr實驗報告 各類pcr之間的區別 

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